Появление сложных технологий в молекулярной и клеточной биологии дало толчок относительно быстрой эволюции наук о жизни, включая токсикологию. На самом деле, основное внимание токсикологии перемещается с целых животных и популяций животных на клетки и молекулы отдельных животных и человека. Начиная с 80-х годов, токсикологи начали применять эти методологии для оценки эффектов химических веществ на живые системы. Как логическое продолжение процесса, эти методы адаптируются к целям анализа токсичности. Прогресс науки сопровождается совершенствованием социально-экономических факторов, изменяющих отношение к оценке безопасности продуктов и потенциального риска.
Экономические факторы особым образом связаны с объемом материалов, подлежащих тестированию. Каждый год на рынках товаров появляются многочисленные новые виды косметики, лекарственных средств, пестицидов, химических и бытовых продуктов. Все эти продукты должны исследоваться на предмет потенциальной токсичности. Кроме того, пополняются списки химических веществ, которые широко используются, но не прошли адекватной оценки. Важная задача получения детальной информации о безопасности всех этих химических веществ с использованием традиционных тестов на животных потребует огромных затрат денежных средств и времени, если это выполнимо в принципе.
Кроме того, имеется ряд проблем, связанных с охраной здоровья и безопасности, а также ростом общественной озабоченности по поводу использования животных в тестировании безопасности продуктов. Что касается безопасности человека, общественность и активисты-защитники природы оказывают серьезное давление на органы власти с тем, чтобы те приняли более жесткие меры регулирования в области химических веществ. В качестве свежего примера можно привести движение ряда экологических групп за запрет хлора и хлорсодержащих продуктов в США. Одна из причин такой экстремистской акции заключается в том, что большинство этих соединений не были адекватно тестированы. С точки зрения токсикологии, концепция запрета целого класса различных химических веществ, основанная лишь на присутствии в них хлора, является антинаучной и безответственной. Однако с точки зрения общественности необходимо иметь подтверждение того, что попадание этих веществ в окружающую среду на представляет существенного риска для здоровья людей. Подобная ситуация еще раз подчеркивает необходимость разработки эффективных и еще более быстрых методов оценки токсичности.
Другая область, вызывающая озабоченность общественности и имеющая отношение к анализу токсичности - это благополучие животных. Растущее число групп по защите животных во всем мире составляют заметную оппозицию в вопросе использования целых животных для тестирования безопасности продуктов. Активные кампании проводятся против производителей косметики, бытовых продуктов и средств личной гигиены с требованием прекратить опыты на животных. В Европе подобные усилия привели к принятию Шестой поправки к директиве 76/768/EEC ("Директива о косметике"). В результате принятия этой Директивы косметические продукты или косметические ингредиенты, испытанные на животных после 1 января 1998 г., запрещено продавать в странах Европейского союза за исключением случаев, когда отсутствуют эффективные альтернативные методы анализа. Хотя эта Директива не имеет юрисдикции относительно продажи такой продукции в США или других странах, она окажет существенное значение на компании, действующие на мировом рынке, включая страны Европы.
Концепция альтернативных методов, лежащая в основе развития других тестов, кроме использования целых животных, известна как "Три R": редукция (reduction ) или снижение количества животных, используемых в опытах; рафинирование (refinement )или усовершенствование протоколов и замена (replacement) животных, используемых в опытах in vitro (то есть опыты, проводимые вне живого животного), компьютерных моделей или тестов на низших позвоночных и беспозвоночных видах. Методика "Три R" была описана в книге, опубликованной в 1959 г. двумя учеными из Великобритании W.M.S. Russell и Rex Burch под названием "Принципы гуманных экспериментальных методов" (The Principles of Humane Experimental Technique). Они высказали мнение, что единственным способом получения достоверных научных результатов можно получить путем проведения гуманного отношения с животными. Они считали необходимым выработать такие методы, чтобы снижать количество используемых животных и, в конечном итоге, полностью заменить их. Интересно, что принципы, предложенные W.M.S. Russell и Rex Burch, игнорировались вплоть до подъема движения в защиту животных в середине 70-х годов. Сегодня концепция "Три R" является самой передовой в области научных исследований, проведения опытов и образования.
Подводя итог, можно сказать, что большое влияние на разработку методологии опытов in vitro оказали различные факторы, появившиеся в последние 20 лет. Пока трудно утверждать, мог ли каждый фактор в отдельности оказать такое влияние на разработку стратегий тестирования токсичности.
Концепция проведения опытов токсичности in vitro Данный раздел посвящен исключительно методам in vitro, применяемым для оценки токсичности в качестве альтернативы опытов с использованием целых животных. Альтернативы опытов без использования животных, такие как компьютерное моделирование и определение количественной зависимости структура-активность обсуждаются в других частях данного раздела. Для проведения опытов in vitro обычно используются клетки животных или человека, взятые вне организма животного. В переводе это словосочетание обозначает "в стекле" и обозначает процедуры, выполняемые на живом материале или компонентах живого материала, выращенных на культуре в чашках Петри или пробирках в определенных условиях. Они противоположны опытам in vivo, то есть проводимых "на живых животных". Хотя достаточно трудно, если вообще возможно, проецировать эффекты химического вещества на сложный организм, если наблюдения ограничены одним видом клетки в чашке, тем не менее, опыты in vitro позволяют получить достаточно информации о врожденной токсичности, а также клеточных и молекулярных механизмах токсичности. Кроме того, они дают ряд преимуществ по сравнению с опытами in vivo, так как, в целом, менее дорогостоящи и могут проводиться в условиях, которые более строго контролируются. Несмотря на то, что небольшое количество животных необходимо для получения клеток для выращивания культур in vivo, эти методы могут рассматриваться как альтернативы по снижению (требуется меньше животных, чем в опытах in vivo) и усовершенствованию (устраняют необходимость подвергать животных вредным токсическим воздействиям во время опытов in vivo).
Для интерпретации результатов опытов токсичности in vitro, определения их потенциальной роли в оценке токсичности и установления связи с общими токсикологическими процессами in vivo, необходимо понимать, какая часть токсикологического процесса изучается. Общий токсикологический процесс состоит из событий, которые начинаются с момента воздействия на организм физического или химического агента, затем следуют клеточные и молекулярные взаимодействия, которые в конечном итоге проявляются в ответной реакции всего организма. Опыты in vitro, как правило, ограничены частью токсикологического процесса, происходящего на клеточном и молекулярном уровне. Виды информации, которые можно получить из опытов in vitro, включают пути попадания и метаболизм, взаимодействия активных метаболитов с клеточными и молекулярными мишенями, и поддающиеся измерению токсические конечные результаты, которые могут служить в качестве молекулярных биомаркеров воздействия. В идеальном случае, механизм токсичности каждого химического вещества с момента воздействия до проявления организмом признаков токсичности должен быть изначально известен с тем, чтобы информация, полученная в результате опытов in vitro, могла быть полностью интерпретирована и связана с ответной реакцией всего организма. Однако это практически невозможно, так как досконально изучены лишь относительно небольшое число токсикологических механизмов. Таким образом, токсикологи сталкиваются с ситуацией, когда результаты опытов in vitro не могут быть использованы для абсолютно точного прогнозирования токсичности in vivo, поскольку механизмы неизвестны. Вместе с тем, в процессе развития опытов in vitro происходит дальнейшее изучение клеточных и молекулярных механизмов токсичности.
Один из ключевых нерешенных вопросов, связанных с разработкой и внедрением опытов in viro, связан со следующим соображением: должны ли опыты быть основаны на механизмах или достаточно быть описательными? Бесспорно, с научной точки зрения разумно использовать только опыты, основанные на механизмах в качестве замены опытам in vivo. Однако при неполном знании механизмов перспектива развития опытов in vitro для полной замены опытах на животных в ближайшем будущем практически равна нулю. Это, тем не менее, не исключает использования более описательных видов анализов, таких как скрининг-тесты, что и происходит сегодня. Благодаря скрининг-тестам удалось резко сократить количество опытных животных. Поэтому до тех пор, пока не будет собрана дальнейшая информация о механизмах, возможно, сохранится необходимость ограниченного проведения опытов, результаты которых будут просто коррелировать с данными, полученными в опытах in vivo.
Тесты цитотоксичности in vitro В настоящем разделе будут описаны некоторые опыты in vitro, разработанные для оценки цитотоксического потенциала химического вещества. В большинстве случаев, эти опыты легко проводить, а анализ полученных данных может быть автоматизирован. Одним из распространенных опытов цитотоксичности in vitro - это нейтрально красный анализ. Он проводится на клеточной культуре, причем в большинстве случаев культура поддерживается в чашках с 96 маленькими лунками диаметром 6,4 мм. Поскольку каждая лунка может быть использована для одного определения, при такой методике опыта можно использовать различные концентрации тестируемого химического вещества, а также обеспечить положительные и отрицательные контрольные группы, каждая из которых состоит из нескольких репликаторов. После введения в клетки различных концентраций тестируемого химического вещества в пределах, как минимум, двух порядков (например, от 0.01 мM до 1 мM), а также положительных и отрицательных контрольных групп химических веществ, клетки промываются и обрабатываются нейтральным красным - красителем, который поглощается и удерживается только живыми клетками. Краситель можно добавлять после удаления тестируемого химического вещества для определения немедленных эффектов, либо добавляется через определенные промежутки времени для определения кумулятивного или отдаленного эффектов. Интенсивность окраски в каждой лунке соответствует числу живых клеток в данной лунке. Интенсивность окраски измеряется при помощи спектрофотометра, который можно оснастить аппаратом для чтения планшетов (планшет-ридер). Это устройство управляется программой для индивидуального измерения каждого из 96 лунок в чашке с культурой. Автоматизированная методология позволяет исследователю быстро проводить эксперимент по изучению зависимости концентрация-ответ и получить полезные статистические данные.
Другим относительно простым анализом цитотоксичности является тест MTT. МТТ - это (3[4,5-диметилтиазол--2-yl]-2,5 дифенилтетразолиумбромид), тетразоловый краситель, который под воздействием ферментов митохондрий приобретает синюю окраску. Только клетки с живыми митохондриями могут осуществлять эту реакцию, следовательно интенсивность окраски прямо связана со степенью неповрежденности митохондрий. Этот тест полезен для обнаружения общих цитотоксических соединений, а также агентов, для которых митохондрии являются специфическими мишенями.
Измерение активности лактатдегидрогеназы (LDH) также используется как основа различных опытов цитотоксичности. Этот фермент обычно присутствует в цитоплазме живых клеток и выделяется в среду клеточной культуры через протечки через мембраны мертвых или умирающих клеток, нарушенные под воздействием токсического агента. Небольшие количества культурной среды можно извлекать в различные промежутки времени после химической обработки клеток для измерения высвобожденной LDH и определять временной характер токсичности. По мере выделения LDH происходит общая оценка цитотоксичности; данный тест полезен, так как его легко проводить в реальное время.
Разрабатываются новые методы определения клеточного поражения. В более сложных методах используются флуоресцентные зонды для измерения различных межклеточных параметров, таких как выброс кальция, изменение pH и потенциала мембраны. В цело, эти зонды чрезвычайно чувствительны и способны обнаруживать более тонкие изменения клетки, тем самым снижая необходимость использовать смерть клетки в качестве конечной точки. Кроме того, многие методы флуоресцентного анализа можно автоматизировать при помощи 96-луночных планшет-ридеров и флуоресцентных планшет-ридеров.
После того, как с помощью одного из этих тестов собраны данные о серии химических веществ, можно определить относительную токсичность. Относительная токсичность химического вещества, определяемая с помощью опыта in vitro, может быть определена как концентрация, вызывающая 50% эффект в конечной точке ответной реакции у клеток, не подвергавшихся воздействию. Этот процесс, который получил название (Эффективная концентрация для 50% клеток), может быть использован для сравнения токсичности различных токсикантов in vitro. (Аналогичный термин, используемый для оценки относительной токсичности , обозначающий концентрацию химического вещества, вызывающего 50% ингибирование клеточных процессов, то есть способность поглощать нейтральный красный. Трудно определить, можно ли сравнивать относительную токсичность in vitro и in vivo химических веществ, так как в системе in vivo существует много ограничительных факторов, таких как токсикокинетика, метаболизм, механизмы восстановления и защиты. Кроме того, поскольку большинство анализов измеряет общие цитогенетические конечные точки, они не базируются на механизмах. Таким образом, согласование между относительной токсичностью in vitro и in vivo носит чисто корреляционный характер. Несмотря на многочисленные трудности и сложности в экстраполяции данных in vitro на in vivo, тесты in vitro приносят большую пользу благодаря своей простоте и дешевизне, и могут быть использованы как скрининг-методы для определения высокотоксичных лекарств или химических веществ на ранней стадии развития.
Токсичность органов-мишеней Опыты iIn vitro также могут быть использованы для оценки токсичности специфических органов-мишеней. Существует ряд сложностей, связанных с методической базой этих опытов, главная из которых заключается в невозможности систем in vitro поддерживать многие свойства органа in vivo. Часто, когда клетки берутся с животных и помещаются в культуру, они имеют тенденцию к быстрой дегенерации и/или дифференциации, то есть теряют органо-подобные функции и становятся более родовыми. Это представляет трудность, связанную с тем, что в течение короткого периода времени, обычно в течение нескольких суток, культуры становятся непригодны для оценки воздействия токсина на конкретный орган.
Многие из этих трудностей удается преодолеть благодаря недавним достижениям в молекулярной и клеточной биологии. Информация, получаемая об окружающей среде клетки in vivo, может быть использована для модуляции условий культуры in vitro. С середины 80-х годов были обнаружены новые факторы роста, а также цитокины, причем многие из них реализуются на коммерческой основе. Добавление этих новых факторов в клеточные культуры помогает сохранить их целостность и сохранить более дифференцированные функции в течение более длительного времени. Другие базовые исследования углубили познания о пищевых и гормональных потребностях клеточных культур, благодаря чему могут быть созданы новые формулы сред. Также достигнут прогресс в определении природных и искусственных внеклеточных матриц, на основании которых можно выращивать новые культуры. Клеточные культуры этих различных матриц могут оказывать заметное влияние на их структуру и функции. Главное преимущество, которое дают эти знания - это возможность осуществлять ненавязчивый контроль окружающей клетки средой в культурах и на индивидуальной основе изучать влияние этих факторов на базовые клеточные процессы и их реакцию на различные химические агенты. Короче говоря, эти системы позволяют глубже заглянуть в механизмы токсичности конкретных органов.
Многие исследования токсичности органов-мишеней проводятся в первичных клетках, которые по определению недавно изолированы из органа и обычно заканчивают свой жизненный цикл в культуре. Многие преимущества связаны с первичными культурами клеток одного вида из органа, исследуемого на предмет токсичности. С точки зрения механизмов, такие культуры весьма полезны для изучения специфических клеточных мишеней химического вещества. В отдельных случаях возможно выращивание культуры двух или более вида клеток одного органа, что создает дополнительные преимущества исследования межклеточных взаимодействий при реакции на токсин. Был создан ряд систем комбинированных культур для кожи таким образом, что они составляли трехмерную структуру, напоминающую кожу in vivo. Также возможно выращивать комбинированные культуры клеток различных органов - например, печени и почек. Такой тип культуры удобен при оценке эффектов, специфических для почечных клеток под воздействием химического вещества, биоактивация которого происходит в печени.
Методы молекулярной биологии также играли важное значение при разработке непрерывных клеточных линий, которые могут быть использованы для анализа токсичности органов-мишеней. Эти клеточные линии образуются путем трансфекции ДНК в первичные клетки. При процедуре трансфекции клетки и ДНК обрабатываются таким образом, что ДНК может захватываться клетками. ДНК обычно берется из вируса и содержит ген или гены, которые при экспрессии обеспечивают иммортализацию клеток (то есть клетки могут жить и расти в течение длительного периода времени). ДНК можно модифицировать таким образом, что иммортализация генов контролируется при помощи специального стимулятора. Преимущество данного типа сообщества заключается в том, что клетки разделяются только в том случае, когда они получают соответствующий химический стимул для экспрессии гена, вызывающего иммортализацию. Примером такого сообщества является крупный Т-антиген, полученный из Simian Virus 40 (SV40) (ген, вызывающий иммортализацию), которому предшествует область стимуляции гена металлотионина, индуцируемого в присутствии металла в культурной среде. Таким образом, после трансфекции гена в клетки, клетки могут быть обработаны слабой концентрацией цинка для стимуляции МТ стимулятора и включения экспрессии Т-антигенового гена. В этих условиях происходит размножение клетки. При удалении цинка из среды, клетки прекращают деление и в идеальных условиях возвращаются в состояние, при котором они выражают функции, характерные для конкретных тканей.
Способность производить иммортализованные клетки в сочетании с прогрессом в технологии клеточных культур во многом способствовала созданию клеточных линий различных органов, включая мозг, почки и печень. Однако прежде чем эти клеточные линии могут быть использованы в качестве заменителя настоящих клеточных видов, необходимо провести их тщательную характеризацию, чтобы определить, насколько "нормальными" они являются в действительности.
Другие системы in vitro, используемые для изучения токсичности органов-мишеней отличаются повышенной сложностью. Как и в системах in vitro, по мере усложнения культуры от отдельной клетки до целого органа, они становятся все более сопоставимыми со средой in vivo, но в то же время более трудно управляемыми при росте числа переменных. Таким образом, возможные преимущества, связанные с переходом на более высокий уровень организации, могут быть потеряны из-за неспособности исследователя контролировать экспериментальную среду. В Таблице 33.9 приведены сравнительные характеристики различных систем in vitro, которые используются для изучения гепатотоксичности.
В токсикологических исследованиях все шире используются срезы культур высокой точности. Появились новые инструменты, позволяющие исследователю получать срезы однородных тканей в стерильной среде. Срезы тканей имеют ряд преимуществ по сравнению с системами клеточных культур, которые заключаются в том, что в них присутствуют все виды клеток органа, сохраняя архитектуру in vivo и межклеточные коммуникации. Таким образом, исследования in vitro могут проводиться для определения вида клетки-мишени внутри органа, а также для изучения токсичности конкретных органов-мишеней. Недостатков срезов является их быстрая дегенерация после первых 24 часов пребывания в культуре, главным образом, вследствие диффузии кислорода в клетки на внутренней стороне срезов. Однако недавние исследования указывают на то, что достаточную аэрацию можно обеспечить путем осторожного переворачивания. Наряду с использованием более сложной среды это позволяет продлить выживание срезов до 96 часов.
Концепция уплощенных тканей аналогична срезам тканей и также может быть использована для определения токсичности химических веществ в конкретных органах-мишенях. Уплощение ткани осуществляется путем удаления кусочка ткани (при исследовании тератогенных свойств - неповрежденного зародыша) и помещения его в культуру для дальнейших исследований. Уплощенные культуры использовались для изучения краткосрочной токсичности, включая раздражение и разъедания кожи, попадания асбеста в трахею, а также изучения нейротоксичности мозговой ткани.
Изолированные перфузируемые органы также могут использоваться для оценки токсичности органов-мишеней. Преимущество этих систем, аналогичные срезам тканей и уплощенных тканей, заключается в том, что в культуре присутствуют все клетки, но без стресса ткани, вызванными манипуляциями по подготовке срезов. Кроме того, они позволяют поддерживать взаимодействия внутри органа. Основным недостатком является небольшой срок жизни, что ограничивает их использование для тестирования токсичности in vitro. Рассматривая эти культуры в качестве альтернативы, они могут рассматриваться как усовершенствование, так как у животных отсутствуют негативные последствия обработки токсикантами in vivo. Однако их использование не приводит к заметному снижению числа животных, используемых в опытах.
Подводя итоги, можно сказать, что для оценки токсичности органов-мишеней используются различные виды систем in vitro. Использование одного или более методов позволяет собрать обширную информацию о токсичности. Имеются определенные трудности, связанные с экстраполяцией данных, полученных в системах in vitro, представляющих относительно небольшую часть токсикологического процесса, на целый процесс, происходящий in vivo.
Опыты in vitro для изучения раздражения глаза По-видимому, самым спорным с точки зрения благополучия животных методом тестирования токсичности на целых животных является тест Драйзе (Draize) на раздражение глаз, проводимый на кроликах. В этом опыте небольшая фиксированная доза химического вещества вводится в один глаз кролика, а другой используется как контрольный. Степень раздражения и воспаления оценивается через различные периоды времени после воздействия. В настоящее время предпринимаются усилия по разработке методологий замены данного теста, который подвергается критике не только из гуманных соображений, но также из-за субъективности оценки и изменчивости результатов. Интересно отметить, что несмотря на критику тест Драйзе является чрезвычайно эффективным для прогнозирования раздражителей глаза человека, особенно раздражающих веществ слабого и умеренного действия, которые трудно определить другими методами. Таким образом, потребность в разработке альтернативы in vitro теста чрезвычайно велика.
Поиски альтернативы тесту Драйзе являются нелегким делом, хотя одному тесту предсказывают большой успех. Уже разработаны различные опыты in vitro и другие альтернативы, некоторые из которых использовались на практике. Более совершенной альтернативой тесту Драйзе, которая по определению является менее болезненной и угнетающей животных, является глазной тест пониженного объема (Low Volume Eye Test), при котором меньшие количества тестируемого материала вводятся в глаза кролика, причем не только из гуманных соображений, но для более точной имитации количества вещества, случайному воздействию которого могут подвергаться люди. Другим усовершенствованием является то, что вещества с рН ниже 2 или выше 11,5 больше не испытываются на животных, из-за известной способности вызывать тяжелую форму раздражения глаза.
По имеющимся оценкам, количество кроликов, используемых в опытах по изучению раздражающего воздействия на глаз косметики, снизилось на 87% в период между 1980 и 1989 гг. Опыты in vitro стали частью подхода с использованием так называемых "тестов-цепочек", а также способствовали значительному сокращению количества опытов на животных. Данный подход предполагает поэтапный процесс, начавшийся с детального изучения всех исторических данных о раздражении глаза, а также данных физико-химических анализов исследуемых веществ. Если в результате этих двух процессов не будет получено достаточной информации, то будут выполнены опыты in vitro на подопытных животных. Дополнительные данные, полученные на основе опытов in vitro, могут быть достаточными для оценки безопасности вещества. В противном случае на заключительном этапе будут проведены ограниченные опыты in vivo. Легко заметить, что данный подход поможет снизить до нуля или, как минимум, резко сократить количество опытных животных, необходимых для прогнозирования безопасности тестируемого вещества.
Набор опытов in vitro, используемых в рамках стратегии "тестов-цепочек", зависит от потребностей конкретной отрасли промышленности. Тестирование раздражения глаз проводится для различных отраслей промышленности: от косметической и фармацевтической до химической. Для различных отраслей промышленности требуется конкретный вид информации, поэтому нельзя создать единый набор опытов in vitro. Набор тестов предназначен, как правило, для оценки пяти параметров: цитотоксичность; физиологические и биохимические изменения в ткани; количественная зависимость структура-активность; посредники, вызывающие воспаление, выздоровление и восстановление. Примером теста цитотоксичности, которая является одной из причин раздражения, является анализ с использованием нейтрального красного с использованием культуры клеток (см. выше). Изменения физиологии и биохимии клеток в результате воздействия химического вещества можно оценить на культурах клеток эпителия роговицы глаза человека. В качестве альтернативы исследователи также изучали целые или рассеченные глазные яблоки свиней цыплят, полученные на бойнях. Многие конечные точки, измеренные в культурах целых органов, аналогичны тем, которые измерены в опытах in vivo, например, помутнение и опухоль роговицы.
Воспаление часто является компонентов химически-индуцированного поражения глаза, и для исследования этого параметра существует ряд анализов. С помощью различных биохимических анализов можно определить присутствие медиаторов, выделяемых во время воспалительного процесса, например, арахидоновая кислота и цитокины. В качестве индикатора воспаления может быть использована Хорионаллантоисная мембрана(CAM) куриного яйца. При опыте с использованием САМ кусочек оболочки зародыша цыпленка возраста 10-14 суток удаляется и обеспечивается доступ к САМ. Затем химическое вещество вводится в САМ, а признаки воспаления, такие как сосудистое кровотечение, отмечаются через различные промежутки времени.
Одним из самых сложных процессов в опытах in vivo является лечение и восстановление поражения глаза. Недавно разработанный инструмент - силиконовый микрофизиометр - позволяет измерить незначительные изменения внеклеточного рН и может быть использован для мониторинга клеток культуры в реальное время. Показано, что этот анализ достаточно точно коррелирует с восстановлением in vivo и используется как опыт in vitro для данного процесса. Выше приведен краткий обзор различных опытов, используемых в качестве альтернативы опыту Драйзе (Draize) для изучения раздражения глаза. Вероятно, в ближайшие годы будет разработана целая серия опытов in vitro и будет подтверждена эффективность каждого из них для использования в конкретных целях.
Подтверждение результатов Решающую роль для принятия в целях регулирования и практического применения опытов in vitro играет подтверждение результатов - процесс, с помощью которого устанавливается степень доверия тесту-кандидату, используемого в конкретных целях. Усилия по определению и координации процесса достоверности предпринимаются как в США, так и в Европе. В 1993 г. в рамках Европейского союза создан Европейский центр достоверных альтернатив опытам на животных (ECVAM) с целью координации усилий и взаимодействию с такими американскими организациями как Центр альтернатив опытам на животным им. Джонса Хопкинса (CAAT), научный центр США, а также Межагентский координационный комитет достоверных альтернативных методов (ICCVAM), в состав которого входят представители Национальных институтов здравоохранения, Агентства по охране окружающей среды США, Управление США по продуктам питания и лекарствам, а также Комиссия по безопасности потребительских товаров.
Подтверждение достоверности опытов in vitro требует значительных усилий в области организации и планирования. Необходим консенсус между государственными регулирующими органами и учеными о приемлемых процедурах, а также контроль со стороны научного консультативного комитета за соответствием протоколов установленным стандартам. Исследования по определению достоверности должны проводиться в нескольких справочных лабораториях, использующих калиброванные наборы химических веществ из банка химических веществ, а также клетки и ткани, поступающие из единого источника. Необходимо продемонстрировать возможность воспроизведения теста-кандидата в различных лабораториях, а результаты должны быть изучены с помощью соответствующего статистического анализа. После проведения различных компонентов исследования достоверности, научный консультативный комитет может сделать рекомендации о достоверности теста-кандидата (тестов-кандидатов) применительно к конкретным целям. Кроме того, результаты исследования должны быть опубликованы в журналах и внесены в базы данных.
В настоящее время проводится работа по определению процесса оценки достоверности. Результаты каждого нового исследования по оценке достоверности используются в последующих работах. Международное сотрудничество и обмен опытом чрезвычайно важны для своевременной разработки широко применяемых серий протоколов, особенно учитывая жесткие сроки, установленные Директивой ЕС по косметике. Это законодательство может придать новый стимул усилиям по подтверждению достоверности. Только по завершению этого процесса может начаться признание методов in vitro различными регулирующими сообществами.
Выводы В настоящей статье дан обзор современного состояния опытов in vitro для определения токсичности. Наука in vitro токсикология является относительно молодой, но она развивается по восходящей. В ближайшем будущем предстоит включить знания о механизмах, полученные в ходе клеточных и молекулярных исследований, в обширный арсенал данных in vivo с тем, чтобы более подробно описать токсикологические механизмы, а также создать парадигму использования данных in vitro для прогноза токсичности in vivo. Только в результате совместных усилий токсикологов и представителей государственных учреждений врожденная ценность методов in vitro может быть реализована.
(Эффективная концентрация для 50% клеток), может быть использован для сравнения токсичности различных токсикантов in vitro. (Аналогичный термин, используемый для оценки относительной токсичности 
, обозначающий концентрацию химического вещества, вызывающего 50% ингибирование клеточных процессов, то есть способность поглощать нейтральный красный. Трудно определить, можно ли сравнивать относительную токсичность in vitro и in vivo химических веществ, так как в системе in vivo существует много ограничительных факторов, таких как токсикокинетика, метаболизм, механизмы восстановления и защиты. Кроме того, поскольку большинство анализов измеряет общие цитогенетические конечные точки, они не базируются на механизмах. Таким образом, согласование между относительной токсичностью in vitro и in vivo носит чисто корреляционный характер. Несмотря на многочисленные трудности и сложности в экстраполяции данных in vitro на in vivo, тесты in vitro приносят большую пользу благодаря своей простоте и дешевизне, и могут быть использованы как скрининг-методы для определения высокотоксичных лекарств или химических веществ на ранней стадии развития.