БИОМАРКЕРЫ
     
     Philippe Grandjean 
     
Слово биомаркер, сокращенное от биологический маркер - термин, обозначающий измеряемое событие, происходящее в биологической системе, каковой является человеческий организм. Явление затем интерпретируется как отражение или маркер более общего состояния организма или продолжительности жизни. В гигиене труда биомаркер обычно используется как индикатор состояния здоровья или риска заболевания.

Биомаркеры используются в исследованиях in vitro и in vivo, которые могут включать исследования на человеке. Обычно выделяют три конкретных вида биологических маркеров. Хотя отдельные биомаркеры трудно поддаются классификации, их можно разбить на три большие группы: биомаркеры воздействия, биомаркеры эффекта и биомаркеры чувствительности (см. Таблицу 33.7).

--------------------------------------------------------------------------------
     
Таблица 33.7     Примеры биомаркеров воздействия или биомаркеров эффекта, используемые в токсикологических 
                              исследованиях в гигиене труда
     
Образец 	Измерение 	Цель 	
Биомаркеры воздействия 	
Жировая ткань 	Диоксин 	Воздействие диоксина 	
Кровь 	Свинец 	Воздействие свинца 	
Кость 	Алюминий 	Воздействие алюминия 	
Выдыхаемый воздух 	Толуол 	Воздействие толуола 	
Волосы 	Ртуть 	Воздействие метилртути 	
Сыворотка 	Бензол 	Воздействие толуола 	
Моча 	Фенол 	Воздействие фенола 	
Биомаркеры эффектов 	
Кровь 	Карбоксигемоглобин 	Воздействие окиси углерода 	
Эритроциты 	Цинк-протопорфирин 	Воздействие свинца 	
Сыворотка 	Холинэстераза 	Воздействие фосфорорганических соединений 	
Моча 	Микроглобулины 	Нефротоксическое воздействие 	
Лейкоциты 	Аддукты ДНК 	Воздействие мутагенов 	
    
--------------------------------------------------------------------------------     

Будучи достаточно достоверными, биомаркеры могут быть использованы в нескольких целях. На уровне индивидуума с помощью биомаркера можно подтвердить или опровергнуть диагноз конкретного вида отравления или другого негативного эффекта, вызванного химическими веществами. У здорового человека с помощью биомаркера можно определить индивидуальную гиперчувствительность к конкретным химическим воздействиям и, таким образом, прогнозировать риск и оказать необходимую консультацию. Применительно к группам работников, подвергшимся воздействию, биомаркеры могут быть использованы для оценки соблюдения требований охраны окружающей среды либо эффективности профилактических мероприятий в целом.

Биомаркеры воздействия
В качестве биомаркера воздействия может выступать экзогенное соединение (или метаболит) внутри организма, продукт взаимодействия между соединением (или метаболитом) и эндогенным компонентом, либо другое событие, связанное с воздействием. Обычно биомаркеры воздействия стабильных соединений, например, металлов, включают измерение концентрации металла в соответствующих образцах, таких как кровь, сыворотка или моча. В случае летучих химических веществ, можно оценить их концентрацию во выдыхаемом воздухе (после ингаляции воздуха, не содержащего загрязнителей). Если соединение метаболизируется в организме, один или несколько метаболитов могут быть выбраны в качестве биомаркеров воздействия; метаболиты часто определяются в образцах мочи.

Современные аналитические методы позволяют выделить изомеры или конгенеры органических соединений, а также определить виды соединений металлов либо отношение изотопов некоторых элементов. Сложные виды анализа позволяют определить изменения в структуре ДНК или других макромолекул, вызываемые связыванием с химически активными веществами. Эти современные методы, несомненно, приобретают исключительно важное значение в исследовании биомаркеров, при этом более низкие пороги определения и повышенная достоверность анализов делают их использование более эффективным.

Особенно многообещающие результаты достигнуты в области биомаркеров воздействия мутагенных химических веществ. Эти соединения являются химически активными и образуют аддукты с такими макромолекулами как белки и ДНК. Аддукты ДНК могут быть обнаружены в клетках крови или тканях биопсий, а специфические фрагменты ДНК могут выводиться с мочой. Например, воздействие окисла этилена приводит к реакциям с основами ДНК, а после выщепления пораженной основы N-7-(2-гидроксиэтил) гуанин выводится с мочой. Некоторые аддукты могут не иметь прямой связи с конкретным воздействием. Например, 8-гидрокси-2ґ-деоксигуанозин отражает окислительное поражение ДНК, причем эта реакция может быть вызвана рядом химических соединений, большинство из которых также включают перокисление липидов.

Другие макромолекулы также могут подвергаться изменениям в процессе образования аддуктов или окисления. Представляет особый интерес тот факт, что такие высоко активные соединения могут образовывать аддукты гемоглобина, которые можно определить как биомаркеры воздействия соединений. Плюсом является то, что из образца крови может быть получено достаточное количество гемоглобина, а при продолжительности жизни красных кровяных телец, равной 4 месяцам, аддукты белка с аминокислотами будут служить индикаторами общего воздействия в течение этого периода.

Аддукты можно определять с помощью таких чувствительных методов, как высокоэффективная жидкостная хроматография, а также ряда иммунологических методов. В целом, аналитические методы являются новыми, дорогостоящими и требуют дальнейшего развития и подтверждения. Для более высокой чувствительности можно использовать анализ с последующей маркировкой , являющейся неспецифическим индикатором поражения ДНК. Постоянно растет количество исследований с использованием этих методов, имеющих потенциальное значение для биологического мониторинга. Вместе с тем требуются более простые и более чувствительные аналитические методы. При ограниченной чувствительности некоторых методов при воздействиях низкого уровня, курение сигарет или другие факторы могут существенно влиять на результаты измерений, затрудняя интерпретацию результатов.

Воздействие мутагенных соединений или соединений, метаболизируемых в мутагены, также можно определить путем оценки мутагенности мочи человека, подвергшегося воздействию. Образцы мочи культивируют с использованием штамма бактерии, в котором специфическая точечная мутация выражена таким образом, который позволяет провести простое измерение. Если мутагенные химические вещества присутствуют в образце мочи, скорость мутации бактерий увеличивается.

Оценка биомаркеров воздействия должна проводиться с учетом временных вариаций воздействия и применительно к различным составным частям (компартментам) организма. Так, временная рамка (рамки), характерные для биомаркера, то есть степень, с которой измерения биомаркера отражают прошлое воздействие (я) и/или аккумулированную нагрузку на организм, должна определяться на базе токсикокинетических данных с целью интерпретации результата. В частности, следует учитывать степень индикации удержания биомаркера в конкретных органах-мишенях. Хотя образцы крови часто используются в исследованиях с помощью биомаркера, периферийная кровь, как правило, не рассматривается как компартмент как таковой, хотя она выступает как средство переноса между компартментами. Зависимость между концентрацией в крови и уровнем в различных органах различных химических веществ варьирует в широком диапазоне и обычно зависит от длительности воздействия и времени, прошедшего с момента воздействия.

Иногда такой тип доказательства используется для классификации биомаркера как индикатора (общей) абсорбированной дозы либо индикатора эффективной дозы (то есть количества вещества, достигшего органа-мишени). Например, воздействие конкретного растворителя можно оценить на основании данных о фактической концентрации растворителя в крови в определенный момент времени после воздействия. Это измерение отразит количество растворителя, абсорбированного организмом. Некоторое количество абсорбированного вещества выводится с выдыхаемым воздухом под воздействием силы давления паров растворителя. Циркулируя в крови, растворитель взаимодействует с различными компонентами организма и, в конечном итоге, будет расщеплен ферментами. Исход метаболических процессов можно оценить, определив конкретные меркаптуровые кислоты, образуемые при конъюгации с глутатионом. Кумулятивная экскреция меркаптуровых кислот более полно отражает эффективную дозу, чем концентрация вещества в крови.

Такие жизненно важные события как воспроизводство и старение могут влиять на распределение химического вещества. Сильное влияние на распределение химических веществ в организме оказывает беременность, при этом многие химические вещества способны проникать через плацентарный барьер, воздействуя на плод. Лактация может привести к выделению липидорастворимых химических веществ, снижая их удерживание в организме матери и повышая их поступление в организм ребенка. Потеря веса или развитие остеопороза может привести к выбросу накопленных химических веществ, возобновляя или увеличивая продолжительность "эндогенного" воздействия на органы-мишени. Другие факторы могут влиять на индивидуальную абсорбцию, метаболизм, удерживание и распределение химических соединений; также известны некоторые биомаркеры чувствительности (см. ниже).

Биомаркеры эффекта
В качестве маркера эффекта может выступать эндогенный компонент или измерение функциональной способности либо другой индикатор состояния равновесия организма или системы органов, на которые оказано воздействие. Такие маркеры эффекта, как правило, являются доклиническими индикаторами аномалий.

Эти биомаркеры могут быть специфическими и неспецифическими. Специфические биомаркеры полезны, так как указывают на биологический эффект конкретного воздействия. Неспецифические маркеры не указывают на конкретную причину эффекта, но отражают общий, комплексный эффект комбинированного воздействия. Таким образом, оба вида биомаркеров могут широко использоваться в гигиене труда.

Не существует четкого разграничения между биомаркерами воздействия и биомаркерами эффекта. Например, можно считать, что образование аддуктов отражает скорее эффект, чем воздействие. Однако биомаркеры эффект обычно указывают на изменения функции клеток, тканей и всего организма. Некоторые исследователи рассматривают как биомаркеры эффекта такие серьезные изменения как увеличение веса печени у лабораторных животных под воздействием химических веществ и замедленный рост детей. В прикладных целях гигиены труда биомаркеры эффекта следует ограничивать индикаторами субклинических или необратимых биохимических изменений, таких как ингибирование ферментов. Наиболее часто в качестве биомаркера используется, по-видимому, ингибирование холинэстеразы, вызываемое отдельными инсектицидами, такими как фосфорорганические инсектициды и карбаматы. В большинстве случаев данный эффект абсолютно необратим, а ингибирование ферментов отражает общее воздействие данной группы инсектицидов.

Некоторые воздействия не вызывают ингибирования ферментов, а повышают их активность. Это относится к ряду ферментов, принадлежащих к семейству Р450 (см. статью "Генетические детерминанты токсической ответной реакции"). Это явление может быть вызвано воздействием отдельных растворителей и полиароматических углеводородов (PAH). Поскольку эти энзимы выражены преимущественно в тканях, где трудно взять образцы для биопсии, активность ферментов определяется косвенно in vivo путем введения вещества, метаболизируемого конкретным ферментом, а затем продукт распада измеряется в моче или плазме.

Другие виды воздействия могут индуцировать синтез защитного белка в организме. Наиболее ярким примером является, по-видимому, металлотионин, связывающий кадмий и способствующий выведению этого металла; воздействие кадмия является одним из факторов, в результате которого увеличивается экспрессия гена металлотионина. Возможно, существуют другие аналогичные, но пока что неизученные защитные белки, которые в дальнейшем могут использоваться как биомаркеры. Среди возможных кандидатов - так называемые белки стресса, ранее известные как белки теплового шока. Эти белки образуются широким спектром различным организмов в ответ на различные вредные воздействия.

Окислительное поражение можно оценить путем определения концентрации малондиальдегида в сыворотке или этана в выдыхаемом воздухе. Аналогичным образом, выведение с мочой белков с малым молекулярным весом, таких как альбумин, может быть использовано в качестве биомаркера ранней стадии поражения почек. Ряд параметров, используемых в штатной клинической практике (например, уровень гормонов сыворотки или ферментов) также могут быть использованы в качестве биомаркеров. Вместе с тем, многие из этих параметров могут быть недостаточно чувствительными для определения ранней стадии поражения.

Другая группа параметров эффекта относится к генотоксическим эффектам (изменения в структуре хромосом). Такие эффекты могут быть обнаружены с помощью микроскопа в белых кровяных тельцах, в которых проходит разделение клетки. Серьезное поражение хромосом - хромосомная аберрация или образование микроядер - может быть обнаружено с помощью микроскопа. Поражение также можно определить, добавляя в клетки краситель во время их размножения. Воздействие генотоксичного агента можно наблюдать в виде усиленного обмена красителя между двумя хроматидами каждой хромосомы (сестринский обмен хроматид). Хромосомные аберрации связаны с повышенным риском развития рака, однако, значение повышенной скорости сестринского обмена хроматид предстоит выяснить.

Более сложный метод оценки генотоксичности основан на конкретной точке мутаций в соматических клетках, а именно: белые кровяные тельца или клетки эпителия, полученные из слизистой оболочки рта. Мутация в конкретном локусе делает клетки способными к росту в культуре, содержащей химическое вещество, которое в иной ситуации является токсичным ( например, 6-тиогуанин). В качестве альтернативы можно провести оценку конкретного генетического продукта (например, концентрации в сыворотке или ткани онкобелков, закодированных конкретными онкогенами). Очевидно, эти мутации отражают общее генотоксическое поражение и не обязательно указывают на причинно-следственную связь с воздействием. Эти методы пока не достигли уровня практического применения в гигиене труда, однако, быстрый прогресс в этом направлении исследований позволяет предположить, что через несколько лет они будут доступны для широкого применения.

Биомаркеры чувствительности
Независимо от того, является он наследственным или индуцированным, маркер чувствительности является индикатором того, что человек чувствителен к эффекту ксенобиотика или эффектам, вызываемым группой подобных соединений. Хотя особое внимание уделялось генетической чувствительности, другие факторы могут играть не менее важную роль. Гиперчувствительность может быть вызвана наследственными причинами, конституцией человека либо факторами окружающей среды.

Способность метаболизировать отдельные химические вещества изменчива и определяется генетически (см. раздел "Генетические детерминанты токсической реакции"). Ряд важных ферментов, по-видимому, контролируются одним геном. Например, окисление чужеродных химических веществ, главным образом, осуществляется семейством ферментов, принадлежащих к семейству Р450. Другие ферменты делают метаболиты более водорастворимыми путем конъюгации (например, N-ацетилтитрансфераза -глутатион-S-трансфераза). Активность этих ферментов контролируется генетически и варьирует в широких пределах. Как указывалось выше, активность может зависеть от введения малой дозы лекарства, что впоследствии регулирует количество метаболита в моче. Уже проведена характеризация некоторых генов и разработаны методы определения генотипа. Результаты важных исследований позволяют сделать вывод, что риск развития некоторых форм рака связан со способностью метаболизировать чужеродные соединения. Многие вопросы пока остаются неясными, ограничивая использование в гигиене труда этих потенциальных биомаркеров восприимчивости.    

Другие врожденные черты, такие как дефицит -антитрипсина, также приводит к дефициту защитных реакций организма, вызывая гиперчувствительность к некоторым видам воздействия.

Большинство ученых связывают восприимчивость с генетической предрасположенностью. Другие факторы, играющие определенную роль, в некоторой степени игнорировались. Например, люди с хроническими заболеваниями могут быть более чувствительны к профессиональным воздействиям. Также, если процесс заболевания или предыдущее воздействие токсичных химических веществ вызывало субклиническое поражение органов, сопротивляемость новым токсическим воздействиям будет, вероятно, ниже. В этом случае биохимические индикаторы функций органов могут быть использованы как биомаркеры восприимчивости. По-видимому, наиболее яркие примеры гиперчувствительности связаны с аллергической реакцией. Если у человека развилась чувствительность к конкретному воздействию, в этом случае в сыворотке можно обнаружить особые антитела. Даже если у человека не развилась чувствительность, другие текущие или прошлые воздействия могут усугублять риск развития негативных эффектов, связанных с профессиональным воздействием.

Важной проблемой является определение совместного эффекта комбинированного воздействия на производстве. Кроме того, индивидуальные привычки и принимаемые лекарства могут вызывать повышенную восприимчивость. Например, при курении сигарет в организм обычно попадает большое количество кадмия. Таким образом, при профессиональном воздействии кадмия у курильщика, в организме которого накопилось достаточное количество этого металла, будет повышенный риск развития заболеваний почек, связанных с воздействием кадмия.

Применение в гигиене труда
Биомаркеры играют чрезвычайно важную роль в токсикологических исследованиях, причем многие из них могут использоваться в биологическом мониторинге. Вместе с тем, существует ряд ограничений. Многие биомаркеры использовались лишь в опытах на животных. Токсикокинетическая модель у других видов не обязательно может отражать ситуацию с человеком, а экстраполяция может потребовать исследования на добровольцах для их подтверждения. Также следует учитывать изменения, связанные с генетическими факторами или конституцией человека.

В некоторых случаях применение биомаркеров воздействия нецелесообразно (например, для оценки химических веществ с коротким жизненным циклом in vivo). Другие химические вещества могут накапливаться либо оказывать воздействие на органы, оценка которых невозможна с использованием штатных процедур, например, нервная система. Путь попадания также может влиять на характер распределения, а следовательно на измерение биомаркера и интерпретацию результатов. Например, прямое воздействие на мозг через обонятельный нерв, вероятно, не поддается обнаружению путем измерения биомаркеров воздействия. Что касается биомаркеров эффекта, многие из них не являются специфическими, а изменения могут быть вызваны различными причинами, включая факторы образа жизни. Возможно, в случае биомаркеров чувствительности интерпретацию результатов следует проводить взвешенно, так как сегодня многое неизвестно о значении индивидуальных генотипов для здоровья человека.

В области гигиены труда идеальные биомаркеры должны отвечать ряду требований. Во-первых, процедура сбора и анализа образцов должна быть простой и надежной. Для оптимального качества аналитических методов необходима стандартизация, в то время как особые требования варьируют в широких пределах. Основные трудности связаны со следующими аспектами: подготовительный этап, процедура отбора проб и порядок обращения с образцами и измерительные процедуры, причем последнее включает ряд технических моментов, такие как калибровка и оценка качества, а также факторы индивидуального порядка, например, обучение и подготовка операторов.

В целях документирования достоверности анализов и слежения за результатами, справочные материалы должны быть основаны на соответствующих матрицах и определенной концентрации токсических веществ либо основных метаболитов на соответствующих уровнях. Для биомаркеров, используемых в целях биологического мониторинга или диагностики, выделенные лаборатории должны иметь документированные аналитические процедуры с четко определенными характеристиками производительности, при этом доступ к документации должен быть свободным для подтверждения результатов. В то же время следует учитывать экономические факторы характеризации и использования справочных материалов для подтверждения качества. Таким образом, качество получаемых результатов и их использование должны соответствовать расходам на поддержание качества, включая справочные материалы, персонал и оборудование.

Другое требование, предъявляемое в биомаркеру - специфичность, как минимум обусловленная исследованием конкретного типа воздействия в четкой зависимости от степени данного воздействия. В противном случае результаты измерения биомаркера будет трудно интерпретировать. Для правильной интерпретации результатов воздействия биомаркера должна быть известна диагностическая достоверность (то есть трансляция величины биомаркера в степень вероятного риска для здоровья). В данной области металлы выступают в качестве парадигмы исследований биомаркеров. Последние исследования показали сложный и едва различимый характер зависимости доза-ответ, причем особенно сложно определить уровень нулевого эффекта и, следовательно, переносимого воздействия. Однако этот вид исследований также иллюстрирует направление и степень совершенствования работы по получению важной информации. Для большинства органических соединений не установлена количественная связь между воздействием и негативным эффектом и здоровьем; во многих случаях даже основные органы-мишени точно не установлены. Кроме того, оценка данных о токсичности и концентрации биомаркера часто затрудняется комбинированным воздействием химических веществ.

Прежде чем использовать биомаркер применительно к гигиене труда, необходимо учесть следующие моменты. Во-первых, биомаркер должен отражать только субклинические и обратимые изменения. Во-вторых, поскольку использование биомаркера может быть связано с риском для здоровья, необходимо принять профилактические меры, которые обеспечат эффективную защиту, если при опыте с биомаркером потребуется снижение воздействия. В-третьих, практическое использование биомаркеров не должно нарушать этические нормы.

Измерения в области промышленной гигиены должны быть сопоставимы с допустимыми нормами воздействия. Аналогичным образом, результаты использования биомаркеров воздействия или биомаркеров эффект должны быть сопоставимы с пределами биологического действия, также называемого коэффициентом биологического воздействия. Эти пределы должны быть согласованы с клиницистами и учеными в конкретных областях, а также с администраторами - "менеджерами риска", которые должны совместно оценить этические, социальные, культурные и экономические факторы. Научное обоснование должно, по возможности, учитывать зависимость доза-ответ, а также информацию о вариантах чувствительности среди популяции, подвергаемой риску. В некоторых странах работники и представители общественности участвуют в процедуре разработки стандартов и вносят важный вклад, особенно при высокой степени неясности в научной области. Одна из главных неясностей - как определить негативный эффект для здоровья, который необходимо избежать - например, оказывают ли вредное воздействие аддукты, образующиеся под влиянием самого биомаркера (например, биомаркера эффекта), и как его избежать. Могут возникнуть трудности этического характера, когда одно и то же соединение имеет различные пределы для побочного и профессионального воздействия.

Информация, получаемая в результате применения биомаркеров, должна передаваться людям, проходящим медицинские обследования. Этическим вопросам следует уделять особое внимание при проведении экспериментальных анализов с помощью биомаркеров, результаты которых не могут быть сегодня интерпретированы с позиции реального риска для здоровья. Для широкого населения сегодня существует недостаточное количество руководств по интерпретации воздействия биомаркеров, кроме концентрации свинца в крови. Также важна степень доверия получаемым результатам (например, проводился ли соответствующий сбор образцов, проводилась ли надежная проверка качества в лабораториях). Особая область, вызывающая беспокойство - это индивидуальная гиперчувствительность. Все вышеперечисленные вопросы должны учитываться для обеспечения обратной связи с экспериментами.

Все секторы общества, которых интересует или непосредственно затрагивает исследование с использованием биомаркеров, должны участвовать в процессе принятия решений либо в определении путей использования результатов исследований. Необходимо разработать специальные мероприятия для предотвращения возможных этических конфликтов, используя законодательные и социальные возможности на региональном или национальном уровне. Однако следует учитывать, что конкретная ситуация связана с определенными проблемами и трудностями, и пока отсутствует конкретная модель участия общественности, способной ответить на все вопросы, связанные с использованием биомаркеров воздействия.